himac APPLICATION
No.77 MARCH 1997
  • 機種:小形超遠心機用S100NTネオアングルロータ
  • 小形超遠心機用S100NTネオアングルロータを用いて株化細胞UT−7からRNAを抽出し、RT−PCR法により血小板第4因子(Platelet Factor 4 : PF4)遺伝子を増幅、合成した例

従来RNAの分離はスイングロータを用いて、一晩(約20時間)程度超遠心分離する手法が一般的でした。
これに対し、当社ではロータの高回転化やアングルロータの応用により、遠心時間の短縮化を検討してきました1, 2)
今回はアングルロータよりも沈降距離の短いネオアングルロータを用いることにより、さらなる迅速化を検討しました。
また、ここでは分離したRNAを用いたRT-PCR法により血小板第4因子(Platelet Factor 4 : PF4)遺伝子3)の増幅、合成を行い、スイングロータにより分離したRNAと同様に実験が可能なことを示しました。

1. 実験結果

(1) サンプル:巨核芽球性白血病由来株化細胞UT-74)

(2) 遠心条件

ロータ 回転速度 遠心時間 温度 Accel. Decel.
S100NT
ネオアングルロータ
100,000rpm 4時間 15ºC 5 7

(3) 電気泳動結果

RNA15μgを使用し、1.0%Agarose−Formaldehyde gel 電気泳動を約16時間行いました。(図1)

(4) RT−PCR法によるPF4遺伝子の増幅5, 6)

本ロータを用いて分離したRNA2μgから逆転写酵素によりcDNAを合成し、さらにPF4遺伝子のプライマーを用いたPCR反応からPF4遺伝子を合成しました。(図2)


2. RNA超遠心分離手法

(1) Cell pellet(5〜10×106 cells)
    ↓  ←Lysate 4M GTC sol 2.7ml
(2) 5.7M CsCl 1.3ml 上に重層(4PAアツチューブ)
(3) 超遠心分離
    ↓  ←Dissolve 150μl ETS buffer×3
(4) エタノール沈殿
(5) Dissolve l0〜20μl DEPC'd DDW


本実験は自治医科大学・血液学教室及び血液学研究部門・造血発生教室との共同研究によるものであり、この応用例が以下に報告されています5, 6)

  • (参考文献)
  • 1) HIMAC APPLICATION No. 55(1993).
  • 2) HIMAC APPLICATION No. 56(1993).
  • 3) Poncz N., et al., Blood, 69 , 219(1987).
  • 4) Komatsu N., et al., Cancer Res., 51 ,341(1991).
  • 5) 菊池次郎ほか、第58回日本血液学会抄録集(1996).
  • 6) Kikuchi J., Furukawa Y., et al., Blood, 89, 3980(1997).