himac APPLICATION
No.72 MARCH 1997
  • 機種:高速冷却遠心機用R5E形エルトリエータロータ
  • エルトリエータ細胞分離システムを用いて、株化細胞UT-7を細胞周期毎に分離した例

エルトリエータ細胞分離システムは遠心力だけでなく、遠心力に対抗する流れの力との二つの力を利用して、細胞レベルの大きさのもの(2〜50μm程度)を分離するシステムです。
このシステムを利用すると、遠心力だけでは難しい細胞のサイズごとの分離が可能となります。
そのため、株化細胞の増殖の際に生じる各増殖段階の中から、同一周期にある細胞の分離に有効となります1, 2)
従来のアフィディコリンのようなDNA合成阻害剤などを用いる必要がないため、細胞に物理的、代謝的に損傷を与えることがなく、短時間に主な周期の細胞を高純度、高回収率で分離することが可能です1)
ここでは、血小板増殖因子(Thrombopoietin)の発見により3)、その分化増殖と血小板産生機構解明のモデルとしての応用が期待される巨核球系株化細胞UT−74)を用いました。

1. 分離結果

(1)フラクション1にG0/G1期の細胞がほぼ100%の純度で得られました。
(2)フラクション5にS期の細胞が約80%の純度で得られました。
(3)フラクション9にG2/M期の細胞が70%の純度で得られました。
以下に分離前(Fig. 1)、フラクション1(Fig. 2)、フラクション5(Fig. 3)、フラクション9(Fig. 4)に得られた細胞のフローサイトメトリー測定結果を示します。
(Propidium Iodide staining and Becton Dickinson flow cytometry analyzer analysis ; FACScan, Becton Dickinson)

表1. 分離条件と結果の一覧表

フラクション 回転速度
(rpm)
流量
(ml/min)
分画時間
(min)
分画量
(ml)
細胞数
(×107コ)
細胞の割合
(%)
備考
分離前 - - - - 18.0 G0/G1:37%
S:61%
G2/M: 2%
Fig.1
1 2,000 17 7.1 200 4.0 G0/G1:100% Fig.2
2 2,000 20 11.8 200 2.6 -  
3 2,000 24 10.0 200 2.1 -  
4 2,000 27 8.3 200 1.5 S:80%  
5 2,000 30 7.4 200 0.8 S:80% Fig.3
6 2,000 33 6.7 200 1.1 -  
7 2,000 36 6.1 200 0.7 -  
8 2,000 39 5.6 200 0.3 -  
9 2,000 42 5.1 200 0.1 -  
10 0 42 4.8 100 0.5 G2/M: 70% Fig.4
合 計 - - 75.3 2,000 13.7 -  

以下にフラクション1、5、9で得られた細胞のライトギムザ染色図を示す。

2. 分離方法

(1) サンプル:ヒト巨核芽球性白血病由来細胞株 UT-7、5×107〜3×108 cells

(2) バッファ:PBS(Dulbecco's PBS)、0.01(w/v)%EDTA−2Na及び1(v/v)%FBS添加

(3) 分離手順

(1) 日立 CF7D2形 小形冷却遠心機を用い、1,000rpm、10分(4℃)遠心し、細胞を集める。
(2) PBSバッファまたは新鮮培養液10mlに再懸濁する。
(3) 回転速度2,000rpm、流量14ml/minでサンプルを供給し、100ml程分画した後、表1に示した条件で分離を行う。

本実験は自治医科大学・血液学教室及び血液学研究部門・造血発生学教室との共同研究によるものであり、この応用例が下記の論文5)に報告されています。

  • (参考文献)
  • 1)Terui, Y., Furukawa, Y., Kikuchi, J., Saito, M., J.Cell. Physiol., 164 , 74(1995).
  • 2)HIMAC APPLICATION No. 65(1994).
  • 3)Bartley, TD. et a1., Cell, 77 , 1117(1994).
  • 4)Komatsu, N. et al., Cancer Res., 51 , 341(1991).
  • 5)Komatsu, N. et al., Blood., 89 , 1182(1997)