himac APPLICATION
No.65 DECEMBER 1994
  • 機種:高速冷却遠心機用SRR6Y形エルトリエータロータ
  • エルトリエータ細胞分離システムを用いて、株化細胞HL-60を細胞周期毎に分離した例

エルトリエータ細胞分離システムは遠心力だけでなく、遠心力に対抗する流れの力との二つの力を利用して、細胞レベルの大きさのもの(2〜50μm程度)を分離するシステムです。
このシステムを利用すると、遠心力だけでは難しい細胞のサイズごとの分離が可能となります。
そのため、HL-601)など株化細胞の増殖の際に生じる各増殖段階の中から、同一周期にある細胞の分離に有効となります。従来のアフィディコリンのようなDNA合成阻害剤などを用いる必要がないため、細胞に物理的、代謝的に損害を与えることがなく、短時間にいくつかの周期の細胞を高純度、高回収率で分離することが可能です2)

1. 分離結果

(1)フラクション1と2に G0/G1期の細胞がほぼ100%の純度で得られました。
(2)フラクション3にS期の細胞が72%の純度で得られました。
(3)フラクション6に G2/M期の細胞が90%の純度で得られました。
以下に分離前(Fig.1)、フラクション2(Fig.2)、フラクション3(Fig.3)、フラクション6(Fig.4)に得られた細胞のフローサイトメトリー測定結果を示します。
(Propidium Iodide staining and Becton Dickinson flow cytometry analyzer analysis; FACScan, Becton Dickinson)


表1. 分離条件と結果の一覧表

フラクション 回転速度
(rpm)
流量
(ml/min)
分画時間
(min)
分画量
(ml)
細胞数
(×107コ)
細胞の割合
(%)
備考
分離前 - - - - 18.0 G0/G1:38%
S:40%
G2/M:20%
Fig.1
1 2,000 17 11.8 200 1.4 G0/G1:100% Fig.2
2 2,000 19 10.5 200 4.6 -  
3 2,000 21 9.5 200 2.3 S:40% Fig.3
4 2,000 23 8.7 200 1.9 -  
5 2,000 25 8.0 200 1.2 G2/M:90%  
6 2,000 27 7.4 200 0.6 G2/M:90% Fig.4
合計 - - 55.9 1,200 12.0 -  

表2. G0/G1期細をDNA合成阻害剤により得た時との比較

  純度 Viability 備考
エルトリエータ
細胞分離システム
100% 100% Fig.5
DNA合成阻害剤* 80% 80% Fig.6

*Aphidicolin 2.5(μg/ml)over night incubation(37℃)3)



2. 分離方法

(1) ヒト前骨髄性白血病由来細胞株 HL-60、1.8×108cells

(2) PBS(Dulbecco's PBS)、0.01%(w/v)EDTA−2Na 及び1%(v/v)FBS添加

(3) 分離手順

1) CF7D 小型冷却遠心機を用い、1,000rpm、10分(4℃)遠心し、細胞を集める。
2) PBSバッファ 10ml に再懸濁する。
3) 回転速度 2,000rpm、流量 14ml/min でサンプルを供給し、100ml 程分画した後、表1に示した条件で分離を行う。

本実験は自治医科大学・血液学研究部門・造血発生学教室との共同研究によるものであり、この応用例が第56回日本血液学会総会において発表されています4)

  • (参考文献)
  • 1) Collins S. J., Gallo R., Gallagher R.E., Nature, 270, 347(1977).
  • 2) Terui Y., Furukawa Y., Kikuchi J., Saito M., J.Cell. Physiol.,164, 74 (1995).
  • 3) 奥田篤行・木村元喜:動物細胞利用実例化マニュアル, p.200−215, リアライズ社(1984).
  • 4) 照井康仁ほか、第56回日本血液学会抄録集, p154(1977).